耐藥基因表達的研究：目前研究中發(fā)現(xiàn)主要的

耐藥機制有：ATP結合盒基因超家族的膜轉運蛋白介導

的耐藥，這些蛋白包括：MDR-1基因編碼的P-糖蛋白，

多藥耐藥相關蛋白，肺耐藥相關蛋白，乳腺耐藥蛋

白等；酶介導的耐藥，包括拓撲導構酶，谷胱甘肽及谷

胱甘肽-S-轉移酶，蛋白激酶C，脫氧胞嘧啶核苷激酶等，

凋亡基因介導的耐藥，如bcl-2家族，p53基因，c-myc

等。多藥耐藥是多因素，多種機制共同作用的結果。

real-time反轉錄 PCR是了解耐藥指導臨床策

略的有用手段，它能觀測用藥前后及復發(fā)時細胞的

耐藥基因mRNA表達變化，從而及時調整方案和評

價疾病的預后 qPCR的主要特點有很多。內蒙古TaqMan熒光探針qPCR機構哪家好

實時熒光定量 PCR 中的 3 個概念，即基線、閾值與 CT

值是理解其原理的關鍵。在線性圖譜中，基線體現(xiàn)在與 X 軸

平行的部分，對數(shù)圖譜中，它體現(xiàn)在背景信號雜亂的部分，系

統(tǒng)會自動形成基線的起始循環(huán)數(shù)與終止循環(huán)數(shù)，也可手動

調節(jié)。熒光閾值指的是熒光強度值，將它界定為 3~15 個循

環(huán)的熒光信號標準差的 10 倍[2]，在擴增曲線里，穿過閾值與

X 軸形成的平行線即為閾值線，系統(tǒng)可自動形成也可手動

設置，手動設定閾值時，在指數(shù)增長期內重復性好的范圍內 內蒙古TaqMan熒光探針qPCR機構哪家好用qPCR檢測細胞內mRNA的表達量。

因此大量有關qPCR發(fā)表的文獻中存在結果證據(jù)不足甚至是相互矛盾的結果，這對科學研究是一個很大的危險?？茖W文獻的發(fā)表和撤回也為人們提出了警示。多數(shù)研究報告缺少足夠的信息加劇了這個問題，使用qPCR的文獻沒有提供足夠的實驗細節(jié)，可以讓讀者評估結果的質量或者重復實驗。具體表現(xiàn)為樣本的采集和處理信息，RNA質量和完整性，反向轉錄細節(jié)，PCR效率，以及分析參數(shù)等等，這些信息常常被忽略，然而樣本正規(guī)化是反對沒有價值的單一參考基因。

定量方法：在real-time Q-PCR中，模板定量有兩

種策略；相對定量和 Absolute Quantitation。相對定量指的是在

一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的量的變化。絕

對定量指的是用已知的標準曲線來推算未知的樣本的

量。標準曲線法的相對定量：由于在此方法中量的表

達是相對于某個參照物的量而言的，因此相對定量的標

準曲線就比較容易制備，對于所用的標準品只要知道其

相對稀釋度即可。在整個實驗中，樣本的靶序列的量來

自于標準曲線，終必須除以參照物的量，即參照物是

1×的樣本，其他的樣本為參照物量的n倍。在實驗中為

了標準化加入反應體系的RNA 或DNA的量，往往在反

應中同時擴增一內源控制物，如在基因表達研究中，內

源控制物常為一些管家基因(如beta- actin，3-磷酸甘油

醛脫氫酶 ***DH等)。 qPCR的主要特點都有哪些呢？

當初始模板核酸濃度≤1 copies/μL 時，這時的影響因素不光是你能否檢測到，還取決于你每次能取到模板的概率。因為在低濃度下，每次取到模板的概率是服從泊松分布的。不明白的可以看看（診斷試劑評價系列 4 - 比較低檢測限，你做對了嗎？）qPCR循環(huán)數(shù)試驗：模板濃度：將標準物質稀釋為0.5，1，2，3，4，5copies/μL，模板上樣量2μL，每個濃度10次重復。擴增體系：使用相同的引物探針和擴增體系進行擴增，擴增體系體積為20μL。該擴增體系的R^2=0.997,E=92.57%,斜率-3.51。循環(huán)數(shù)：分別進行40個循環(huán)和45個循環(huán)，其他條件完全一致。RT-qPCR 的 Ct 值偏大主要有兩種情況，一種是所有基因 Ct 都偏大，另外一種是個別基因 Ct 偏大。重慶TaqMan熒光探針qPCR實驗

qPCR的好處您了解多少呢？內蒙古TaqMan熒光探針qPCR機構哪家好

Ct值能否直接換算成模板拷貝數(shù)？通過制作標準曲線（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58~-3.10）的方法可以獲得未知樣品的初始模板拷貝數(shù)，前提是需要樣品與標準品同時擴增，定量標準品需要使用標準物質等定量準確的物質（OD260/280換算的的拷貝數(shù)誤差很大），即使如此定值結果仍存在一定的誤差。熒光定量PCR是否為定量方法？雖然名字里有「定量」，但是qPCR的間接定量方式又復雜，又受很多因素影響，又不準確，在計量領域是不被認可的。目前的核酸檢測方法中只有數(shù)字PCR是真正的定量檢測方法，其余的都是定性檢測方法。內蒙古TaqMan熒光探針qPCR機構哪家好