Ct 會受到閾值的影響，每次試驗(yàn)由于樣品和儀器的不同會導(dǎo)致基線不同，進(jìn)而影響閾值和 Ct 值。模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關(guān)系，起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩(wěn)定的。Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復(fù)2遍，Ct值也會存在差異。做 qPCR,不要鉆進(jìn)唯Ct值的牛角尖。吉林SYBR熒光染料qPCR公司

Ct值能否作為評價qPCR試劑盒的指標(biāo)？qPCR試劑的評價需要從分析敏感性（比較低檢測限），分析特異性的（交叉反應(yīng)），重復(fù)性（精密度），診斷敏感性，診斷特異性等多個指標(biāo)去衡量（診斷試劑評價系列2-核酸檢測方法（更正），診斷試劑評價系列4-比較低檢測限，你做對了嗎？）。只憑Ct值的高低去判斷一個qPCR試劑盒的優(yōu)劣太片面，不同試劑盒的Ct值不具有可比性。有些試劑盒采取先進(jìn)行幾個循環(huán)的預(yù)擴(kuò)增，再進(jìn)行正式循環(huán)的做法就是為了使Ct值看起來更低。貴州實(shí)時熒光定量qPCR公司哪里有實(shí)時熒光qPCR實(shí)驗(yàn)就找上海融享生物科技有限公司。

其實(shí)沒有一項(xiàng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是 so easy 的，即便是看起來毫無難度的 qPCR 。但同樣地，任何一項(xiàng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)都是有套路的，包括 qPCR ，就看你套路深不深。對于像病毒載量這樣的定量實(shí)驗(yàn)來講，標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量起到?jīng)Q定性作用。R2值太低一般是由于稀釋操作不夠準(zhǔn)確，或者加樣操作誤差太大；E值太低則可能是由于探針引物設(shè)計(jì)不夠好，或者Ta值不合適；而E值太高則提示可能出現(xiàn)了非特異擴(kuò)增或者PCR擴(kuò)增受抑制的情況。根據(jù)qPCR的MIQE準(zhǔn)則，合適的擴(kuò)增效率E在95%～105%，這就是努力的方向。很多人會有疑問，為啥要千方百計(jì)的優(yōu)化擴(kuò)增效率呢？擴(kuò)增效率的提高可以提升qPCR檢測體系的靈敏度、動態(tài)范圍，減少非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生；數(shù)據(jù)的重復(fù)性及可信度也會得到提高；Tm值優(yōu)化是提高擴(kuò)增效率特別直接特別簡單的方法，只需要一臺具有溫度梯度功能的qPCR設(shè)備即可，時間上還用不了半天。

Bio-Rad 的 qPCR 設(shè)備全系標(biāo)配 8 個溫度梯度功能，只要運(yùn)行一次實(shí)驗(yàn)，就能找到較合適的退火溫度條件。專門的蜂巢式反應(yīng)模塊，保證了很好的溫度均一性，即使在較快的升降溫過程中同樣如此。優(yōu)化溫度梯度實(shí)驗(yàn)中，你只需要配好 8 個組分完全相同的反應(yīng)體系（模板量適中即可）。在然后的結(jié)果中，能到得到較小 Cq 值的溫度點(diǎn)即為比較好退火溫度。通常，比較好的退火溫度是狹窄的一個范圍，而不是單一的溫度點(diǎn)，比如 57℃～58℃ 即為比較好的退火溫度。對于染料法的 qPCR 體系，還要通過熔解曲線分析檢查各退火溫度下產(chǎn)物的特異性情況，優(yōu)先沒有非特異性擴(kuò)增，且 Cq 值較小的退火溫度為較適退火溫度。SYBRGreen法qPCR機(jī)構(gòu)哪家好？

InSilico工具如BLAST或者等效性搜索是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有用的。應(yīng)當(dāng)記錄任何可預(yù)測的假基因的同源或者其它不可預(yù)見的基因，并且作為一個序列比對提供給審稿人。但是特異性必須用直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)(凝膠電泳，解鏈曲線圖形，DNA序列，擴(kuò)增片段大小，和/或限制性酶切)驗(yàn)證有效性。設(shè)計(jì)之初可預(yù)測寡核苷酸的熔解溫度(Tm)的算法，但是退火的實(shí)際比較好溫度必須通過實(shí)驗(yàn)決定。雖然引物優(yōu)化已成為過去時，但是不當(dāng)?shù)耐嘶饻囟葍?yōu)化對實(shí)驗(yàn)質(zhì)量有很大的影響還是明確的。引物二聚體的顯可引起PCR低效率，在探針和SYBRGreenⅠ的實(shí)驗(yàn)中可能產(chǎn)生假陽性。引物優(yōu)化的一些證據(jù)應(yīng)提給審稿人，比較好還要提交退火溫度或者M(jìn)g2+濃度，Cq值，熒光點(diǎn)陣圖與循環(huán)次數(shù)，和/或熔解曲線。SYBR green染料法相對較便宜。湖北實(shí)時熒光定量qPCR機(jī)構(gòu)哪家好

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擴(kuò)增子是發(fā)生PCR反應(yīng)的靶標(biāo)基因片段。由于qPCR只是用于表征靶標(biāo)基因的數(shù)量，并不需要得到其全長序列，因此擴(kuò)增子區(qū)段的選擇具有相當(dāng)?shù)撵`活性，在基因讀碼框的內(nèi)部即可（mRNA的分析除外）。區(qū)段的選擇一般遵循以下原則：擴(kuò)增子長度一般在75～200bp范圍。如果太長，擴(kuò)增效率會降低；而太短又無法與引物二聚體區(qū)分開。盡可能避免產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。這會極大的影響擴(kuò)增效率。目前很多網(wǎng)站都可以在線預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，操作簡單。盡可能避免了單堿基連續(xù)重復(fù)超過4次（如AAAA、CCCC等）。但有時在擴(kuò)真核生物基因組時難以保證。GC含量盡可能在50%～60%。這一點(diǎn)在擴(kuò)增某些物種（如放線菌）基因組時同樣難以保證。高GC模板擴(kuò)增需要加入一些特殊成分來優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，目前也有商品化的試劑。吉林SYBR熒光染料qPCR公司