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來源: 發(fā)布時間:2024-07-29

通過并行化不同激光波長的激光掃描,研究人員增加了在相同時間內(nèi)可以成像的體積,同時保持了高的時間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長的鈣信號熒光探針,將神經(jīng)元群體的活動標(biāo)記為兩種不同的顏色,同時激發(fā)兩種不同波長的探針,從而實現(xiàn)了兩種顏色的并行數(shù)據(jù)記錄。為了實現(xiàn)三維空間成像,研究人員還在兩個激光束上配置了快速變焦系統(tǒng),即一個電透鏡和一個空間光調(diào)制器。因此,可以以10Hz的速度同時記錄10個500微米和500微米的平面,覆蓋600微米的深度,覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結(jié)構(gòu),體積內(nèi)可以記錄2000多個神經(jīng)元。雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當(dāng)中;美國雙光子顯微鏡ultima

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雙光子顯微鏡的應(yīng)用由于適合動態(tài)成像,雙光子顯微鏡一經(jīng)問世便很快應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、遺傳發(fā)育、藥物代謝等領(lǐng)域。雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對***神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度、細(xì)胞運動、分子相互作用等進(jìn)行直接成像監(jiān)測,而且能夠進(jìn)行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱。同時,雙光子顯微鏡能動態(tài)監(jiān)測**在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移,并可對**治療過程中*細(xì)胞的變化進(jìn)行實時觀測和評估。隨著光學(xué)技術(shù)、熒光探針技術(shù)、計算機(jī)成像技術(shù)的發(fā)展,雙光子顯微技術(shù)會得到更大提升和更廣的應(yīng)用,未來不僅用于基礎(chǔ)研究,也將擴(kuò)展到臨床應(yīng)用。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡原理雙光子顯微鏡角膜成像。

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雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景,首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像,在亞微米級成像,此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似;雙光子顯微成像能夠?qū)崟r、在體、原位、無創(chuàng)地,根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性,區(qū)分成像;雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像,在無造影劑的前提下,利用自發(fā)熒光、二次諧波、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。雙光子顯微鏡技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具有巨大的潛力,該領(lǐng)域還未形成標(biāo)準(zhǔn)和體系,需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐,通過研究人體基于多光子成像技術(shù),進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息,找到與疾病的細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)、診斷和***特征的關(guān)聯(lián)關(guān)系,共同探究生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制,篩選鑒定**、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù),建立全新的多光子細(xì)胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫,定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。

從雙光子的原理和特點,我們可以清楚地得出雙光子的優(yōu)點:☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,因此該波段的光對細(xì)胞和組織的光損傷很小,適合長期研究;☆穿透能力強(qiáng):與紫外光相比,可見光和近紅外光的穿透能力更強(qiáng),因此受生物組織散射的影響更小,解決了生物組織深層物質(zhì)的層析成像問題;☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小,只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā)熒光,雙光子吸收被限制在焦點處體積約為波長三次方的范圍內(nèi);☆漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點處,焦點外的區(qū)域不會發(fā)生光漂白;☆熒光收集率高:與共焦成像相比,雙光子成像不需要濾光片(共焦),提高了熒光收集率,直接導(dǎo)致圖像對比度的提高;☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長,瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲*為單光子激發(fā)產(chǎn)生的1/16,減少了散射的干擾;光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇性激發(fā),因此可以用來對生物組織中的一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像;雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。

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雙光子的來源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎獲得者M(jìn)ariaGoeppertMayer提出,并在30年后因為激光而得到實驗驗證,但WinfriedDenk用了近30年才發(fā)明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,首先要理解非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生的非線性過程,需要極高的電場強(qiáng)度,電場取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小,脈沖寬度越窄,雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長有關(guān),所以關(guān)鍵變量只有激光脈沖寬度?;谝陨戏治?,能夠輸出高重復(fù)率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光已經(jīng)成為雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優(yōu)勢:雙光子吸收只能在焦平面形成,而在焦平面之外,由于光強(qiáng)較低,無法激發(fā),所以雙光子成像更清晰。雙光子顯微鏡的探測器,該怎么選用?進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細(xì)胞進(jìn)行特定實驗;美國雙光子顯微鏡ultima

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出,30年后因為有了激光才得到實驗驗證,但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,這要求極高的電場強(qiáng)度,而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,脈寬越窄,雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?;谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢:只有焦平面處才能形成雙光子吸收,而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,而近紅外相比可見光穿透更深,對生物樣品損傷更小。美國雙光子顯微鏡ultima