當組織冷凍切片附在帶有spatialbarcode的空間轉(zhuǎn)錄組芯片上時，通過透化處理，細胞內(nèi)的mRNA釋放出來，從而被芯片上帶有oligo-dT的探針捕獲。被捕獲的mRNA開始逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA中包含了spatialbarcode序列。通過上機測序，可以將每個mRNA轉(zhuǎn)錄的序列映射回組織切片中的映射回組織切片中的原始位置。Visium空間轉(zhuǎn)錄組的重點在于芯片部分：正式文庫構建的芯片上有4個捕獲區(qū)域（6.5mmX6.5mm，可以檢測4個樣本）每個捕獲區(qū)域含有約5000個被條形碼標記的點（barcodedspots）每個spot直徑55μm，每個spot能捕獲1-10個細胞spot與spot中心點之間的距離為100μm每個spot含有上百萬個可以與mRNA結合的捕獲探針，每個探針上都帶有獨特的spatialbarcodes，用以標記捕獲的mRNA的空間位置。烈冰一站式多平臺測序服務：立足科學研究，解碼生命本質(zhì)。重慶scRNA空間轉(zhuǎn)錄組測序價格
為同時獲得空間表達和組織學背景信息，該方案首先將FFPE組織切片置于Visium基因芯片上進行組織學染色和成像，然后利用切片下方Visium基因芯片上的探針進行表達定量。由于FFPE樣本通常存在RNA高度降解的問題，針對FFPE樣本的Visium空間基因表達解決方案無法像新鮮凍存組織樣本一樣利用完整mRNA具有的poly（dA）序列進行mRNA捕獲。該方案采用針對編碼基因的成對RNA模板連接探針（RTL）與mRNA雜交。左側(cè)探針（LHS）具有部分Read 2序列，右側(cè)探針（RHS）具有合成的poly(A)序列。左右探針與mRNA雜交后彼此連接，而mRNA被RNase降解。組織透化后，被連接的成對探針與芯片上包含空間Barcode、UMI和poly(dT）序列的引物序列捕獲，并且空間Barcode和UMI序列被延伸到成對探針序列上。攜帶空間Barcode的探針序列用于進行測序文庫構建和測序。測序序列上的空間Barcode用于將測序序列定位到組織切片圖像上，UMI用于基因表達定量。烈冰生物空間轉(zhuǎn)錄組平臺從樣本處理到終端數(shù)據(jù)分析，只要您需要，烈冰提供全流程的無憂服務。
當前的技術主要有四種策略：1、基于組學實驗結合空間重建的計算策略這種計算方法可以充分利用內(nèi)在基因表達模式或共表達的趨勢，從單個細胞的大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中重構細胞間的環(huán)境。然而，這些推論方法在某些情況下只呈現(xiàn)空間趨勢或特定組織的總體布局。2激光切割與NGS測序結合的策略基于LCM的轉(zhuǎn)錄組學或基因組學成功地獲得了單個細胞的空間轉(zhuǎn)錄組，盡管其通量很低，但是在可以標記成千上萬個單個細胞位買的多路復用條形碼策路可行之前，將少量細胞的數(shù)據(jù)粗略地整合到構成組織的巨大背景中，可能具有一定價值。3、基于熒光物質(zhì)原位的轉(zhuǎn)錄組學基于圖像的原位轉(zhuǎn)錄組學在很大程度上增加了可檢測區(qū)域，但也存在一些問題，例如幾種smFISH方法很難從包括信號干擾、轉(zhuǎn)錄本積累等復雜背景中提取單個細胞。4、基于身核苷酸的空間條碼加上NGS測序。
空間轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)質(zhì)量和玻片有效區(qū)域的利用率、貼片的質(zhì)量和透化時間息息相關。貼片質(zhì)量不良會影響總的有效spot數(shù)等；而透化不合理會導致spot的reads數(shù)、基因中位數(shù)等參數(shù)。而在特異性基因表達方面，我們也可以統(tǒng)計空間轉(zhuǎn)錄組群體的特異性基因表達即Markergene，將他們在組織切片以及空轉(zhuǎn)上進行著色。我們也可以對于任意一個已知的基因或者數(shù)據(jù)庫中的一些細胞Marker，然后將其在基因表達在空間轉(zhuǎn)錄組的切片以及HE染色上展示自己的基因表達進而了解，群體中的可能的細胞組成關系。烈冰生物為您提供一站式全流程空間轉(zhuǎn)錄組測序服務。
相比于常規(guī)的測序手段，空間轉(zhuǎn)錄組測序有幾個明顯的優(yōu)勢：1.將轉(zhuǎn)錄組信息與空間信息對應，體現(xiàn)組織內(nèi)部的異質(zhì)性：每個區(qū)域獨特的條形碼使測序結果與空間位置形成一一對應關系。雖然暫時還無法精細到單細胞層面，但是這樣的區(qū)域劃分也已經(jīng)足以展現(xiàn)出組織內(nèi)部不同區(qū)域間的轉(zhuǎn)錄組差異。2.不影響對全組織進行分析：芯片上捕獲的全轉(zhuǎn)錄組在同一個反應中完成測序，能有效降低多次重復實驗中的誤差。測序結果如果不按照條形碼歸類，則直接體現(xiàn)的是切片全組織的轉(zhuǎn)錄組情況，無需再做單獨檢測。3.為進一步的研究提供指導意見：常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測序，對后續(xù)實驗的指導仍然停留在全組織層面。而空間轉(zhuǎn)錄組測序則可以標識出更有價值的研究區(qū)域，引導研究者將組織進一步細分。烈冰空間轉(zhuǎn)錄組，多平臺任意選擇，隨心組合，優(yōu)化您的科學研究，助力探索新的科學視角。杭州烈冰科技空間轉(zhuǎn)錄組平臺
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