雖然數(shù)字PCR的優(yōu)勢與臨床應(yīng)用前景已在許多研究中得到確認(rèn),但想要進(jìn)一步在臨床廣泛應(yīng)用,數(shù)字PCR需要針對以下幾個方面進(jìn)行升級:商用數(shù)字PCR系統(tǒng)需要進(jìn)一步提升樣本檢測通量以充分滿足COVID-19普篩的需求;需要制定國家或行業(yè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn);需要產(chǎn)業(yè)界進(jìn)一步降低設(shè)備成本;基于數(shù)字PCR的**檢測試劑盒需要經(jīng)過嚴(yán)格多中心評價,并獲得NMPA、FDA、CE等監(jiān)管機構(gòu)的認(rèn)證。隨著科研和產(chǎn)業(yè)的持續(xù)研發(fā)和投入,未來數(shù)字PCR將在實驗室或醫(yī)院得到更多的應(yīng)用,用于解決科研和臨床問題,提供更準(zhǔn)確的診斷結(jié)果。數(shù)字PCR有望成為下一代分子診斷的**技術(shù)。低豐度DNA模板分子的精確定量。山東高精確度數(shù)字PCR經(jīng)驗豐富
數(shù)字PCR采用的策略概括起來非常簡單,就是“分而治之”(divide and conquer),這種做法非常類似于計算機科學(xué)中的“分治算法”,將一個標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中,在每個反應(yīng)器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子( DNA模板) ,實現(xiàn)“單分子模板PCR擴增”,擴增結(jié)束后,通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。在實際的數(shù)字PCR實驗中,事實上是通過呈現(xiàn)兩種信號類型的反應(yīng)器比例和數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計算出原始樣本中的模板拷貝數(shù)。浙江數(shù)字PCR數(shù)字PCR歡迎咨詢在gDNA長度≥20kb或進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測實驗時,必須對樣品進(jìn)行酶切處理。
拷貝數(shù)變異(CNV)研究:數(shù)字PCR直接讀取陽性信號,通過泊松分布校正得到目標(biāo)基因的***拷貝數(shù),為拷貝數(shù)變異的研究提供了***的檢測精度。采用數(shù)字PCR能夠有效對二代測序(NGS)和微陣列比較基因組雜交(aCGH)等實驗結(jié)果進(jìn)行驗證,并具有檢測周期短、成本低、樣本通量高等特點。低豐度DNA模板分子的精確定量:由于絕大部分微液滴中只含單個或不含模板分子,使得低豐度DNA模板分子的擴增不受高豐度模板分子擴增的競爭抑制:與此同時,樣品中可能存在的抑制劑也在分配到微液滴的過程中進(jìn)行了相對稀釋,作用于單個微液滴內(nèi)模板擴增的抑制劑數(shù)量大幅降低,從而提高PCR擴增對抑制劑的耐受程度,因此可應(yīng)用于諸多臨床樣品(如血液、尿液、糞便、痰液、胸腹水、腦脊液等)中痕量核酸標(biāo)記物的檢測。一般而言,定量PCR的檢測靈敏度約在1%,NGS的靈敏度可達(dá)到1%,而數(shù)字PCR的檢測下限可輕松實現(xiàn)0.01%。
QuantaLife 利用油包水微滴生成技術(shù) 開發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術(shù),這也是**早出現(xiàn)的相對成熟的數(shù)字PCR平臺,在運行成本和實驗結(jié)果穩(wěn)定性方面都基本達(dá)到了商品化的標(biāo)準(zhǔn)。2011年,QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收購,其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號儀繼續(xù)在市場上銷售,這個早期型號為dPCR概念的普及和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展發(fā)揮了重要作用。2013年該公司又推出了升級型號QX200。2012年,RainDance公司推出Raindrop型號數(shù)字PCR設(shè)備,這個設(shè)備將其原有的二代測序文庫制備平臺技術(shù)平移到數(shù)字PCR技術(shù)平臺,在高壓氣體驅(qū)動下,將每個標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割成包含100萬至1000萬個皮升級別微滴的反應(yīng)乳液, 該公司的創(chuàng)始人之一Darren Link表示這種超高的微滴數(shù)目可以為用戶“提供更高的檢測動態(tài)范圍,適用于處理更大濃度差異的不同樣品”。微反應(yīng)單元體積大小一致且穩(wěn)定是泊松分布準(zhǔn)確計算的前提。
*****的實時監(jiān)控:已有數(shù)篇文章報道了使用數(shù)字PCR技術(shù)對患者***過程中的循環(huán)**DNA(ctDNA)進(jìn)行檢測,實時監(jiān)控疾病進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺*、乳腺*和腸*等多種**患者中都取得了令人鼓舞的結(jié)果。與影像學(xué)及其他常規(guī)指標(biāo)相比,ctDNA突變及豐度改變通常會提前數(shù)月出現(xiàn),這樣就可以提醒醫(yī)生及時調(diào)整***方案,使患者得到更有效的***。無創(chuàng)產(chǎn)前篩查:唐氏綜合征、地中海貧血或胎兒遺傳性耳聾基因檢測等,目前無創(chuàng)檢測標(biāo)本來源主要為孕婦血液,檢測胎兒DNA會受到母體DNA的干擾,依靠數(shù)字PCR可提高檢測準(zhǔn)確性。對比NGS,數(shù)字PCR技術(shù)可以提高工作效率、降低檢測成本。PCR 擴增和熒光信號分析。天津準(zhǔn)確數(shù)字PCR經(jīng)驗豐富
良好的引物探針設(shè)計是數(shù)字PCR實驗獲得成功的關(guān)鍵因素之一。山東高精確度數(shù)字PCR經(jīng)驗豐富
乳腺*的分型:ER,PR和HER2是乳腺***常用的分子標(biāo)志物,在患者在開始***之前必須要明確這幾個分子標(biāo)志物的具體狀態(tài)。傳統(tǒng)的檢測方法是通過IHC來確定蛋白的表達(dá)情況,而HER2檢測也還可以通過FISH來判斷染色體的擴增情況。盡管相應(yīng)的檢測都有明確的指南來加以規(guī)范,但是在臨床實踐過程之中,有些檢測結(jié)果不可避免的還是會受到人為操作和判讀的主觀影響,從而導(dǎo)致同一樣本的結(jié)果偏差,為臨床的治療帶來了極大的困惑。有研究者嘗試采用四重數(shù)字PCR方法,對這幾個標(biāo)志物同時進(jìn)行定量檢測。95例石蠟標(biāo)本的對比分析結(jié)果顯示,HER2,ER和PR與IHC的一致性分別為96.8%,91.5%和85.1%,而ROC曲線下面積則分別為0.991,0.977和0.920,說明該方法與IHC方法有較好的一致性。此外,相比于IHC方法,數(shù)字PCR方法還具有操作和判讀標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果重復(fù)性好、檢測周期短、標(biāo)本使用量少等優(yōu)勢,未來在臨床將會有很好的應(yīng)用前景。山東高精確度數(shù)字PCR經(jīng)驗豐富