液滴數(shù)字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技術(shù)，即將DNA模板與連接引物的磁性微球以極低的濃度(比如單拷貝) 包裹于油水兩相形成的納升至皮升級(jí)液滴中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物富集在磁性微球上，收集破乳后進(jìn)行測(cè)序。通過油水兩相間隔得到的以液滴為單位的 PCR 反應(yīng)體系，比微孔板和 IFC 系統(tǒng)更容易實(shí)現(xiàn)小體積和高通量，而且系統(tǒng)簡(jiǎn)單，成本低，因此成為理想的數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)。Vogelstein 及其同事提出的 BEAMing 技術(shù)就是一種基于乳液PCR的數(shù)字PCR系統(tǒng)。Lu 等也采用 BEAMing 和連接酶反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì) mRNA 的定量分析。Zhou 等在 BEAMing PCR 擴(kuò)增后破乳，將連接不同產(chǎn)物的磁珠包被在聚丙烯酰胺凝膠中制成磁珠陣列進(jìn)行熒光檢測(cè)。目前有超過130萬(wàn)條經(jīng)鎖核酸修飾的引物，提供至少3種設(shè)計(jì)方案以滿足不同跨外顯子區(qū)域的檢測(cè)需求。四川數(shù)字PCR方案
常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)都需要已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于樣品測(cè)定在各種條件上不會(huì)完全一致，會(huì)造成PCR擴(kuò)增效率的差異，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。而ddPCR不受標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)影響，可以進(jìn)行***定量。dPCR也有一些缺點(diǎn)，數(shù)字PCR系統(tǒng)成本高，通量有限、操作繁瑣等不足。芯片式dPCR由于芯片加工成本高，系統(tǒng)復(fù)雜度高，使得商業(yè)化優(yōu)勢(shì)不是特別明顯，特別是目前大多數(shù)分子診斷qPCR也能夠很好的滿足需求，dPCR增加的收益成本比并不算高。液滴式相對(duì)芯片式成本有所下降，但典型的液滴式dPCR液滴形成和PCR擴(kuò)增和檢測(cè)都分別在不同儀器中完成，增加了很多操作，也增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性，從這點(diǎn)上看全自動(dòng)熒光定量PCR做的更好。四川Digital PCR數(shù)字PCR售后分析可以用來驗(yàn)證二代測(cè)序(NGS)。
1999年，Bert Vogelstein創(chuàng)造了“數(shù)字PCR”一詞，文章正式報(bào)道于美國(guó)科學(xué)院院刊PNAS，并表明該技術(shù)可用于發(fā)現(xiàn)罕見的**突變。作者是美國(guó)**研究者、霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員貝爾特·福格爾斯泰因（Bert Vogelstein）。目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。
20 世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴(kuò)增效率影響，擴(kuò)增結(jié)束后通過直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式來計(jì)算每個(gè)反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來實(shí)現(xiàn)***定量分析。德立替尼***HR+/HER2-轉(zhuǎn)移性乳腺*。
數(shù)字PCR（Digital PCR-dPCR）技術(shù)是一種新的核酸檢測(cè)和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR（qPCR）技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用***定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測(cè)目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測(cè)方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到***的應(yīng)用，這項(xiàng)技術(shù)在極微量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)和表達(dá)量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可，而其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、**標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測(cè)序文庫(kù)精確定量和結(jié)果驗(yàn)證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。數(shù)字PCR可以用來研究基因表達(dá)。上海準(zhǔn)確數(shù)字PCR服務(wù)
可以用于白血病融合基因檢測(cè)。四川數(shù)字PCR方案
使用不合適的引物可能會(huì)引入引物二聚體、非特異性擴(kuò)增等，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在此，小Q建議您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需做以下幾個(gè)方面的檢查，***需對(duì)設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，以確保引物的特異性！在數(shù)字PCR***定量實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于基因突變檢測(cè)、基因表達(dá)差異分析和拷貝數(shù)變異鑒定等對(duì)實(shí)驗(yàn)精細(xì)性要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要特異性更高的Assay。QIAGEN基于QIAcuity數(shù)字PCR平臺(tái)開發(fā)并驗(yàn)證了針對(duì)上述常見應(yīng)用的700多組dPCR LNA Assay，所有Assay均經(jīng)過鎖核酸修飾來增強(qiáng)其對(duì)互補(bǔ)序列的親和力和特異性，進(jìn)而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。四川數(shù)字PCR方案