CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗證：CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗證實驗是否成功，仍需要高靈敏度的檢測方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團隊發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對核酸進行高靈敏度的定性檢測，但精確定量評估時仍采取了數(shù)字PCR進行確認。*****的伴隨診斷：常用體液來源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標本中的DNA，有正常脫落體細胞和病變脫落細胞兩種來源，前者的量遠大于后者。通過微液滴處理能在每個微液滴中有效減少正常體細胞DNA的干擾，實現(xiàn)**標記物的有效檢測，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測、乳腺*/胃*的HER2基因擴增檢測等，應用于**精細醫(yī)學的伴隨診斷?？梢杂脕眚炞C二代測序(NGS)。湖北熒光信號數(shù)字PCR歡迎咨詢
傳統(tǒng) PCR 或定量 PCR 反應都是在96/384孔板中進行的，因此早期的數(shù)字PCR技術(shù)也采用 96 /384孔板作為反應單元。但是數(shù)字PCR技術(shù)的靈敏度取決于反應單元的總數(shù)n，因此，理論上反應單元數(shù)越多越有利于提高靈敏度和準確度，普通的96 /384孔板無法滿足檢測的需要。而且，在96 /384 孔板中進行的PCR反應體系通常大于5μl，由試劑消耗引起的高成本問題令人望而卻步。針對上述問題， Morrison 等在25mm×75mm不銹鋼芯片上刻蝕了3072個直徑為300μm的微反應室(如圖2a所示)，每個反應單元的體積降低至33 nl。該芯片可在商品化 PCR 儀上使用，與384 孔板的檢測靈敏度相當，但反應體積降低為原來的1/64，樣品通量提高了24倍。隨著反應單元數(shù)目的成倍增加，反應體積從微升級降至納升級，傳統(tǒng)的操作人員采用移液器加試樣的方式已經(jīng)無法滿足快速精細取樣的要求，因此需要借助高通量自動點樣儀或機械手等設(shè)備，這無疑大幅提高了系統(tǒng)的成本和操作的復雜性。熒光信號數(shù)字PCR經(jīng)驗豐富一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應。
單細胞的基因表達分析：基因表達分析有助于了解細胞和組織的特征及其如何應對發(fā)育和環(huán)境信號的改變。檢測已知和未知基因轉(zhuǎn)錄水平的方法在過去的四十多年來發(fā)生了翻天覆地的變化，變得更加有效，更加敏感，定量更加精細，能夠一次性對大量的基因轉(zhuǎn)錄本進行分析。但是，在組成復雜的細胞混合物中，盡管***表達的基因可以被識別出來，但來自于少數(shù)細胞群體（例如干細胞）的轉(zhuǎn)錄本卻很可能會被掩蓋掉，尤其是在每個細胞中以低豐度形式出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本。為了解決這個問題，單細胞檢測技術(shù)應用而生，而且逐漸受到了越來越多的重視。ddPCR在單細胞分析中的優(yōu)勢在于它不需要標準曲線就能進行***定量。而且，由于能夠以非常高的敏感性區(qū)分至少五種不同的基因轉(zhuǎn)錄本，因此無需進行其他方法所要求的單細胞cDNA預擴增，這可以消除預擴增和NGS文庫準備中潛在的轉(zhuǎn)錄本定量失真，能夠能加真實的反映單細胞群體中關(guān)鍵基因的特征。
微小殘留病變（minimalresidualdisease，MRD）：隨著化療、靶向***、造血干細胞移植等***方式的改進，血液**的***效果日益改善。微小殘留?。∕RD）導致的復發(fā)是目前血液*****的一大難題。動態(tài)監(jiān)測MRD對于評價***療效、預測疾病復發(fā)、實施個體化***具有重要的指導意義。MRD檢測方法需滿足可定量、標準化、便捷性的要求。目前**常見的是流式細胞學（flowcytometry,FCM）和PCR兩大類,但只有靈敏度高于10-4才能被納入標準化評估。數(shù)字PCR技術(shù)，其有限稀釋的特點可降低復雜的背景干擾，濃縮低豐度目的基因信號，從而提高MRD檢測的靈敏度。在慢性髓系白血病中，Wang等同時用dPCR和qPCR檢測了61名CML患者的外周血，這些患者在每3個月一次連續(xù)3次的qPCR檢測中，已經(jīng)檢測不到BCR-ABL，dPCR檢測到18%的患者是陽性的。在隨后的隨訪中，dPCR能比qPCR提前幾個月檢測到BCR-ABL的升高。在淋系白血病的BCL2-IGHMBR檢測中，Drandi等在222例樣本中驗證了dPCR和qPCR方法的一致性，還成功地將dPCR應用于3例qPCR無法檢測的病例。數(shù)字PCR作為目前靈敏度和準確性比較高的分子檢測方法，非常適用于微小殘留病變評估。目前有超過130萬條經(jīng)鎖核酸修飾的引物，提供至少3種設(shè)計方案以滿足不同跨外顯子區(qū)域的檢測需求。
可以使用幾種不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設(shè)分子種群遵循泊松分布來估計不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應體系中目標分子的拷貝數(shù)可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計算，從而解決了多個目標分子存在于單個液滴中的可能性。同時，從公式也可以看出，隨著反應陽性體系數(shù)（X）的增加，體系中目標分子的拷貝數(shù)相對于X會有較大的差距，隨著X的持續(xù)增加，數(shù)字PCR結(jié)果的不確定度也隨著提高，總體來說，數(shù)字PCR陽性體系的數(shù)量不得超過總體系數(shù)量的80%。另一個方面，N的增加會使整個數(shù)字PCR體系具有較大的線性范圍，并可以提高反應的靈敏度、穩(wěn)定性以及可重復性。因此，目前dPCR都需要在成本可控的情況下，增加分配的腔室數(shù)和液滴數(shù)?？梢杂脕頇z測外泌體micRNA。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR歡迎咨詢
近年來，Bio-Rad、凱杰、賽默飛等巨頭公司紛紛通過收購、投資等方式布局數(shù)字PCR業(yè)務。湖北熒光信號數(shù)字PCR歡迎咨詢
微生物（病毒、細菌等）的檢測：疾病預防控制中心、出入境檢驗檢疫局系統(tǒng)的實驗室可以將基于TaqMan探針法的定量PCR體系無縫地轉(zhuǎn)移到數(shù)字PCR上，從而滿足該類實驗室對于檢測結(jié)果的要求：靈敏度更高、重復性更好、無需依賴標準曲線的***定量結(jié)果。其他應用：數(shù)字PCR還可以用于轉(zhuǎn)基因成分的檢測、移植排斥監(jiān)控、腸道菌群分析以及藥物基因組檢測等領(lǐng)域。隨著數(shù)字PCR熒光通道的增加和多指標檢測的成熟，數(shù)字PCR將會進入更多應用領(lǐng)域，有力推動生命科學、醫(yī)學診斷、檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的快速發(fā)展。湖北熒光信號數(shù)字PCR歡迎咨詢